繼上(shàng)文對基因工程抗體(tǐ)相關情況進行(xíng)闡述後，本文接着對抗體(tǐ)藥物的大(dà)規模制(zhì)備與分離純化以及抗體(tǐ)的作(zuò)用機制(zhì)進行(xíng)論述。

抗體(tǐ)大(dà)規模制(zhì)備和(hé)純化是抗體(tǐ)藥物生(shēng)産的關鍵技(jì)術(shù)，是抗體(tǐ)藥物産業化轉化的重要環節，目前國際上(shàng)抗體(tǐ)生(shēng)産在中試規模産量達到5g/L以上(shàng)，商業化生(shēng)産反應器(qì)規模達到20000L，單批次純化抗體(tǐ)産量超過20kg，遠高(gāo)于國內(nèi)水(shuǐ)平。抗體(tǐ)生(shēng)産工藝技(jì)術(shù)在過去三十多(duō)年裏得(de)到了迅猛的發展（20世紀80年代初的單抗藥物剛起步時(shí)，每升抗體(tǐ)産量隻有(yǒu)10mg），主要體(tǐ)現在3個(gè)方面：1）抗體(tǐ)表達水(shuǐ)平大(dà)大(dà)提高(gāo)，生(shēng)産成本大(dà)幅降低(dī)；2）生(shēng)産工藝安全性和(hé)穩定性大(dà)幅提高(gāo)；3）工藝放大(dà)和(hé)大(dà)規模哺乳動物細胞培養經驗日漸豐富。

抗體(tǐ)的成功大(dà)規模生(shēng)産始于高(gāo)水(shuǐ)平的工藝開(kāi)發，好的工藝開(kāi)發需同時(shí)具備高(gāo)表達（決定了工藝的經濟性）、高(gāo)穩定性（來(lái)源于對細胞株和(hé)工藝的深刻理(lǐ)解）和(hé)可(kě)放大(dà)性3個(gè)優點。同時(shí)工藝放大(dà)對抗體(tǐ)藥物大(dà)規模的制(zhì)備也很(hěn)重要，成功的工藝放大(dà)是對産品質量（首要考慮）、産率和(hé)細胞活率的影(yǐng)響降到最低(dī)。

大(dà)規模哺乳動物細胞培養是重組蛋白和(hé)抗體(tǐ)藥物生(shēng)産的主要平台技(jì)術(shù)。懸浮細胞培養是上(shàng)市抗體(tǐ)藥物生(shēng)産工藝的共同選擇。懸浮細胞培養操作(zuò)簡單，手工操作(zuò)少(shǎo)，易放大(dà)，還(hái)可(kě)借鑒傳統發酵工藝積累的大(dà)量經驗。相比細菌、酵母等表達系統，哺乳動物細胞是一個(gè)低(dī)效率的蛋白表達系統，要提高(gāo)抗體(tǐ)生(shēng)成效率主要可(kě)通(tōng)過兩方面實現：提高(gāo)生(shēng)産工藝的細胞密度和(hé)增加單個(gè)細胞的表達效率。

培養基是細胞培養和(hé)抗體(tǐ)生(shēng)産的核心，提供了細胞生(shēng)長的環境。細胞最主要的能量來(lái)源是葡萄糖和(hé)谷氨酰胺，氨基酸主要用于合成蛋白質和(hé)核酸。培養基中一般包括所有(yǒu)20種氨基酸，一方面提高(gāo)工藝的穩定性，另一方面可(kě)減輕細胞的代謝壓力。種子擴增，起于細胞複蘇，止于生(shēng)産反應器(qì)的接種。種子擴增的目的是通(tōng)過一系列不同體(tǐ)積和(hé)不同類型的細胞培養裝置，不斷加大(dà)細胞培養體(tǐ)積，為(wèi)抗體(tǐ)生(shēng)産獲得(de)足夠的細胞。單抗生(shēng)産工藝的開(kāi)發主要集中在4方面——宿主細胞、表達載體(tǐ)、反應器(qì)操作(zuò)和(hé)培養工藝，決定了最終工藝及産品的效率和(hé)質量。

大(dà)規模抗體(tǐ)生(shēng)成主要是利用流加工藝和(hé)灌注工藝。流加工藝較灌注工藝有(yǒu)3個(gè)優點——可(kě)靠性高(gāo)、易放大(dà)和(hé)生(shēng)産成本低(dī)。流加工藝操作(zuò)簡單，應用靈活，易于放大(dà)，已成為(wèi)國際抗體(tǐ)商業化生(shēng)産的主要平台技(jì)術(shù)，多(duō)家(jiā)制(zhì)藥企業已成功實現10000L到25000L的大(dà)規模抗體(tǐ)生(shēng)産。流加工藝開(kāi)發和(hé)優化的重點就是加料的平衡和(hé)代謝副産物的抑制(zhì)。灌注工藝較流加工藝也有(yǒu)3個(gè)主要優點——細胞生(shēng)長環境更佳、适合生(shēng)産已降解的産品和(hé)細胞密度更高(gāo)。灌注工藝的重點是細胞分離裝置和(hé)培養基的優化。分離裝置可(kě)将大(dà)部分細胞截流在反應器(qì)中，是實現灌注換液和(hé)提高(gāo)細胞密度的關鍵。灌注工藝因細胞分離裝置的限制(zhì)，主要用于2000L及以下規模。

細胞反應器(qì)自重組蛋白藥物剛起步就湧現出了一批，但(dàn)随着實踐的深入，最簡單的罐式攪拌反應器(qì)成為(wèi)大(dà)規模細胞培養采用的主流反應器(qì)類型。罐式攪拌反應器(qì)具有(yǒu)1）結構簡單，操作(zuò)方便，清洗容易；2）細胞生(shēng)長環境均一性好；3）細胞保持懸浮；4）易放大(dà)；5）傳氧方式簡單；6）大(dà)量發酵罐操作(zuò)經驗可(kě)以借鑒等優點。罐式反應器(qì)應用的最大(dà)挑戰來(lái)自攪拌和(hé)鼓泡帶來(lái)的高(gāo)剪切力，可(kě)通(tōng)過攪拌速度、鼓泡方式、氣泡大(dà)小(xiǎo)的控制(zhì)，以及添加細胞保護劑等來(lái)解決。

細胞培養的工藝放大(dà)是抗體(tǐ)大(dà)規模生(shēng)産的一個(gè)關鍵技(jì)術(shù)，是成功進行(xíng)中試生(shēng)産及商業化生(shēng)産的必要條件。目前還(hái)沒有(yǒu)成熟的指導原則，更多(duō)的是依靠經驗和(hé)逐級放大(dà)的摸索。細胞培養工藝放大(dà)難度的根本原因在于哺乳動物細胞對剪切力的高(gāo)敏感性。在工藝放大(dà)中，工藝參數(shù)（包括與放大(dà)無關的參數(shù)）影(yǐng)響較小(xiǎo)，操作(zuò)參數(shù)（與放大(dà)直接相關的參數(shù)，包括攪拌速率、鼓泡速度、堿液添加速度等）是工藝放大(dà)的重點。反應器(qì)放大(dà)後攪拌速率的确定是工藝放大(dà)最重要的一個(gè)環節。轉速越高(gāo)，剪切力越大(dà)。反應器(qì)在放大(dà)後應盡量控制(zhì)剪切力，避免高(gāo)剪切力帶來(lái)的細胞和(hé)抗體(tǐ)産品質量變化。但(dàn)為(wèi)避免均一性降低(dī)帶來(lái)的負面影(yǐng)響，在細胞耐受的情況下，大(dà)型反應器(qì)的攪拌強度也應盡量提高(gāo)。

抗體(tǐ)分離純化的主要目的是将抗體(tǐ)與工藝相關雜質和(hé)産品相關雜質分離，最終獲得(de)高(gāo)純度、低(dī)潛在危害的抗體(tǐ)藥物。純化過程中需要去除的工藝相關雜質包括細胞、細胞碎片、宿主細胞蛋白、宿主細胞核酸及培養基與加料液成分，需去除的産品相關雜質主要包括抗體(tǐ)片段和(hé)聚集體(tǐ)。純化過程還(hái)需具備足夠的病毒滅活去除能力，以去除宿主細胞自身表達的內(nèi)源病毒樣顆粒和(hé)未及時(shí)發現的外源病毒。抗體(tǐ)分子由于結構和(hé)物理(lǐ)化學性質上(shàng)的相似，其分離工藝大(dà)緻相同，多(duō)為(wèi)利用蛋白A來(lái)捕獲抗體(tǐ)，并利用了至少(shǎo)1個(gè)離子交換層析作(zuò)為(wèi)精純步驟。一個(gè)典型的抗體(tǐ)純化工藝為(wèi)：離心、過濾——蛋白A層析——低(dī)PH孵育——陰離子層析——陽離子層析——病毒過濾——UF/DF。随着技(jì)術(shù)的進步，大(dà)規模生(shēng)産抗體(tǐ)瓶頸從抗體(tǐ)表達轉移到了抗體(tǐ)純化。

純化的第一步是将培養液上(shàng)清與細胞及細胞碎片分離開(kāi)來(lái)，大(dà)規模抗體(tǐ)生(shēng)産主要采用連續分離的方法。蛋白A是一個(gè)金黃色葡萄球菌胞壁蛋白，對抗體(tǐ)純化有(yǒu)很(hěn)好的通(tōng)用性，能去除培養上(shàng)清中大(dà)部分雜質。蛋白A親和(hé)層析工藝開(kāi)發和(hé)優化的重點是抗體(tǐ)載量、停留時(shí)間(jiān)（流速）、淋洗和(hé)洗脫條件。抗體(tǐ)捕獲後，還(hái)需進一步精純，一般采用兩步層析以保持足夠的純化冗餘。現在越來(lái)越多(duō)的公司也開(kāi)始采用一步精純來(lái)提高(gāo)收率和(hé)純化速度，降低(dī)成本。純化的另一個(gè)重要目的是有(yǒu)效去除滅活收料液中的內(nèi)源逆轉錄病毒樣顆粒，以及未檢測到的外源病毒。病毒滅活步驟主要包括低(dī)PH孵育和(hé)病毒過濾。

在可(kě)預見的将來(lái)，抗體(tǐ)生(shēng)成還(hái)将保持現有(yǒu)的工藝路線，但(dàn)工藝的效率、通(tōng)量會(huì)進一步增加，成本會(huì)進一步降低(dī)。再過幾年，我國包括抗體(tǐ)生(shēng)産工藝開(kāi)發和(hé)工藝放大(dà)在內(nèi)的全套關鍵技(jì)術(shù)會(huì)逐步提高(gāo)到國際先進水(shuǐ)平。

任何化合物分子的功能都是由其結構決定的，單抗也是這樣。單抗由抗原結合部位（Fab）和(hé)可(kě)結晶部位（Fc）構成一個(gè)Y形結構。其中，Fab識别結合抗原靶标，決定單抗的特異性和(hé)親和(hé)力；Fc結合表達于免疫效應細胞表面的Fc受體(tǐ)，以及血液中的補體(tǐ)和(hé)清道(dào)夫受體(tǐ)（FcRn），決定了單抗的免疫效應以及在機體(tǐ)內(nèi)的半衰期。

抗體(tǐ)Fab相關作(zuò)用機制(zhì)由于抗原不同的生(shēng)理(lǐ)學機制(zhì)，可(kě)以分為(wèi)識别遊離分子靶點的單抗和(hé)識别細胞表面受體(tǐ)的單抗。1）識别遊離分子靶點的單抗。遊離存在于血液循環中的細胞因子、生(shēng)長因子、生(shēng)物毒素以及人(rén)侵的病毒等，都可(kě)以作(zuò)為(wèi)單抗的作(zuò)用靶點。中和(hé)抗體(tǐ)的作(zuò)用機制(zhì)是通(tōng)過結合抗原進行(xíng)中和(hé)，使抗原喪失結合受體(tǐ)的能力，進而喪失生(shēng)物學功能。2）識别細胞表面受體(tǐ)的單抗。靶點抗原表達在特定細胞表面，具有(yǒu)特定功能，例如細胞激活、生(shēng)長或遷移。抗體(tǐ)可(kě)通(tōng)過結合、拮抗和(hé)激活的方式與靶受體(tǐ)相互作(zuò)用。抗體(tǐ)的Fc部位決定了抗體(tǐ)的效應功能，包括抗體(tǐ)依賴細胞毒作(zuò)用（ADCC）和(hé)補體(tǐ)依賴細胞毒作(zuò)用（CDC）。此外，單抗還(hái)具有(yǒu)類似疫苗的功能，能激發獲得(de)性免疫反應，使機體(tǐ)獲得(de)針對腫瘤抗原的免疫性。對抗體(tǐ)機制(zhì)的了解，有(yǒu)助于投資者對抗體(tǐ)治療方案優劣和(hé)具體(tǐ)抗體(tǐ)前景的分析。不同抗體(tǐ)的作(zuò)用過程就好比一場(chǎng)“戰争”，期間(jiān)的排兵布陣、敵我态勢的變化非常有(yǒu)趣，有(yǒu)時(shí)間(jiān)可(kě)以私聊。由于篇幅所限，在此就不再一一展開(kāi)論述具體(tǐ)的作(zuò)用機制(zhì)是如何的了。

圖表一：單抗的作(zuò)用機制(zhì)

    至此，抗體(tǐ)藥物基本技(jì)術(shù)就已基本介紹完畢，接下來(lái)會(huì)談談抗體(tǐ)藥物應用技(jì)術(shù)等方面的內(nèi)容，敬請(qǐng)期待。

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